بهبود تولید پروتئاز قلیایی توسط تثبیت سلول های باسیلوس کلوزی

پروتئازها آنزیم هایی هستند که هیدرولیز کلیه پروتئین ها را بر عهده دارند و از مهمترین و پرکاربردترین آنزیم ها به شمار می روند. هدف از این تحقیق تثبیت باکتری باسیلوس کلوزیehy_l2 به منظور افزایش تولید پروتئاز قلیایی بود. بهینه سازی شرایط تثبیت با استفاده از نرم افزار آماری انجام شد. سپس تغلیظ و خالص سازی آنزیم جهت تعیین برخی ویژگی های آن صورت گرفت. روش بهینه سازی پاسخ سطحی rsm با استفاده از روش ccd برای تعیین شرایط بهینه تولید پروتئاز و کاهش رها شدن سلول از دانه های کلسیم آلجینات صورت گرفت. در این روش سه فاکتور غلظت سدیم آلجینات، کلسیم کلراید و میزان تلقیح بهینه سازی شدند و میزان پروتئاز تولیدی و رها شدن سلول از دانه های آلجینات نیز مورد سنجش قرار گرفت. مدل ارائه شده دارای r2 برابر9965/0 و f-value برابر18/1492بود، لذا برای تتبیین شرایط آزمایش در محدوده مورد نظر قابل استفاده می باشد. شرایط بهینه پیش گویی شده توسط نرم افزار شامل مقادیر (w/v)%3 و (w/v) %44/3 به ترتیب برای سدیم آلجینات و کلسیم کلراید بود و میزان بهینه تلقیح نیز برابر ml15 بود. نتایج حاصل از آزمایش در شرایط بهینه مقادیر u/ml956 و 2/2 را برای پروتئاز و رها شدن سلول را به دست داد که به مقدار پیشگویی شده نزدیک بود. تثبیت بر روی حامل های اسفنج پلی یورتان و باگاس نیز صورت گرفت. این نتایج نشان داد که آلجینات برای تولید آنزیم و حفظ سلول ها مناسب تر از سایر حامل های به کار رفته است. کشت های غیر مداوم تکراری با استفاده از سلول های تثبیت شده در حامل آلجینات در مقیاس فرمانتور 2 لیتری صورت گرفت. شرایط بهینه بدست آمده در برنامه rsm، جهت راه اندازی فرمانتور مورد استفاده قرار گرفت، سه بار کشت های غیر مداوم درون فرمانتور تکرار شدند و میزان پروتئاز بدست آمده و مقدار سلول های رها شده از دانه های آلجینات در تکرار اول u/ml1400 و 4 و در تکرار دوم u/ml1250 و 3/3 و در تکرار آخر نیز برابر u/ml1110 و 3 بود که مجموعاً در این سه تکرار u/ml3760 پروتئاز به دست آمد. تغلیظ آنزیم پروتئاز با استفاده از سولفات آمونیوم %70 و تخلیص آن با استفاده از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی deae-52 صورت گرفت. درصد بازیافت آنزیم بعد از کروماتوگرافی نسبت به نمونه اولیه به %64 رسید و فاکتور تخلیص بعد از کروماتوگرافی 02/3 بود. همچنین فعالیت ویژه حاصل از تخلیص آنزیم برابر u/ml935 بود که میزان پروتئین آن mg7/0 و با فعالیت u/ml655 گزارش شد. با استفاده از ژل الکتروفورز جرم ملکولی آنزیم حدود 30 کیلودالتون تعیین شد. km و vmax آنزیم پروتئاز خالص شده با استفاده از کازئین به عنوان سوبسترا تعیین شد و به ترتیب برابر mµ370 و u/ml360 بود. همچنین اثر بازدارنده های pmsf و edta بر آن باعث کاهش فعالیت آن شد و ki در حضور این بازدارنده ها به ترتیب mµ 250 و mµ 252 بود و همچنین میزان vmax این دو مهارکننده به ترتیب u/ml 64 و u/ml 92 به دست آمد. همچنین اثر بازدارنده ها بر آنزیم بر روی ژل زایموگرام باعث محو شدن باندهای مربوطه گردید که نشان دهنده وجود متالو و سرین پروتئازها در نمونه بود.